甜菜夜蛾电压门控钠离子通道基因cDNA全长的克隆及序列分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

甜菜夜蛾spodoptera exigua，是一种世界性分布、多食性和间歇性暴发的重要农业害虫。长期以来化学药剂的不合理使用，导致甜菜夜蛾对杀虫剂产生了不同程度的抗药性。除了对拟除虫菊酯、有机磷、氨基甲酸酯类传统杀虫剂产生抗性以外，近年来，已陆续报道对新型杀虫剂如氯虫苯甲酰胺、多杀菌素产生了不同水平的抗药性。

氰氟虫腙是德国巴斯夫公司开发的缩氨基脲类杀虫剂，能有效地控制鳞翅目、鞘翅目害虫。其作用机制全新，是一种电压门控钠离子通道阻断剂；通过附着在钠离子通道的受体上，阻断钠离子通过轴突膜，进而抑制神经冲动，导致虫体过度放松、麻痹，而最终死亡。在全球大量的室内毒力测定中，均未发现与现有的各类杀虫剂如有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯、烟碱类、阿维菌素以及苯甲酰脲类存在交互抗性。

电压门控钠离子通道是ddt和拟除虫菊酯类杀虫剂的主要靶部位，其敏感度降低即会引起抗性。昆虫神经系统对拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感性下降主要与神经细胞膜上钠离子通道的敏感性降低有关。milani(1954)首先使用kdr一词来描述家蝇对ddt的击倒作用产生的抗性，并首先报道了家蝇体内kdr的存在。氰氟虫腙虽然与茚虫威、dtt和拟除虫菊酯类杀虫剂的作用靶标相同，但作用结合位点不同，作用方式也不同。目前，公开发表的文章中还未报道由于昆虫钠通道突变而导致的对氰氟虫腙的抗药性。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

获得甜菜夜蛾电压门控钠离子通道基因cdna的全长，通过cdna序列比对分析，寻找抗性昆虫种群的基因突变，探索甜菜夜蛾对氰氟虫腙产生抗药性的分子机理。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

采用rna提取试剂盒从甜菜夜蛾5龄幼虫的头部提取总rna，每个rna样品用oligo(dt)₁₅ 引物和super script iii 反转录酶合成第一链cdna。根据已报道的家蚕、稻纵卷叶螟、美洲棉铃虫等昆虫钠通道的序列和某些昆虫的est数据，搜索比对钠通道的同源序列，比对其同源性，设计兼并性引物，对甜菜夜蛾钠通道基因进行pcr扩增与克隆。pcr产物利用胶回收试剂盒进行回收纯化，克隆到t-载体中，阳性克隆送相关公司测序。采用clontech公司smart race试剂盒，用race技术扩增得到钠通道基因cdna的全长。具体的操作步骤参见各试剂盒的使用说明。

可行性分析：

4. 研究创新点

1. 本研究为首次克隆甜菜夜蛾电压门控钠离子通道基因

2. 本研究是在较早发现甜菜夜蛾对氰氟虫腙抗药性（即将发表）基础上，进行抗药性分子机理的研究

3. 本研究为研究氰氟虫腙的作用位点与作用机理奠定基础

5. 研究计划与进展

研究计划：

2013.08.012013.08.15 分子实验方法学习，比对昆虫钠通道序列设计兼并引物

2013.08.162013.09.15 rt-pcr技术克隆甜菜夜蛾钠通道cdna的中间片段