水稻A20/AN1型锌指蛋白SAP7的功能研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

干旱、高盐、低温等非生物胁迫是影响植物生长发育和作物高产的重要限制因子。其中，超过10%的耕地受干旱和盐胁迫影响。并且，在全球范围内，盐碱化和沙漠化土地急剧增加，大部分主要作物的平均产量降低超过50%（bray et al.,2000）。因此，研究植物响应各种环境胁迫，特别是干旱和盐害的机制，在生产中具有重要作用。

植物在长期进化过程中，形成了一系列机制，以抵抗各种非生物胁迫。它可以感知各种非生物胁迫，并通过改变代谢，生长及发育促发相应的反应。该调节网络主要包括：信号感受子，蛋白相互作用信号传递网络，转录因子与启动子，信号输出相关蛋白或代谢产物（bartels et al.,2005）。其中，转录因子在植物逆境胁迫信号转导中具有重要的作用，它主要通过调节下游基因的表达对各种胁迫做出响应。通过基因芯片技术从转录组水平分析鉴定出植物中各种响应环境胁迫的转录因子，主要包括ap2/erebp，bhlh，nac，bzip和锌指蛋白（shinozaki et al., 2003; nakashima et al.,2006）。锌指蛋白（zinc finger protein）是一类具有指状结构域的转录因子，主要通过与dna、rna的结合或与其它蛋白的相互作用调控基因的表达。锌指蛋白广泛分布于动植物体中，是真核生物中一个重要蛋白超家族。根据锌指结构中cys和his的位置和数目，锌指蛋白可以分为多个亚家族，包括c2h2、c2c2、c2hc等。目前为止在植物中已经鉴定出多个具有锌指结构的功能基因，其广泛地参与植物的各种生命过程（takatsuji., 1998; 黄骥等,2004）。

本实验室利用生物信息学分析手段和分子生物学技术从水稻基因组中鉴定并分离了一个新的基因家族，该家族成员编码的蛋白质都包含了a20和an1锌指结构，即a20/an1型锌指蛋白。在人类的研究中，a20最初鉴定为一种受肿瘤坏死因子（tnf）诱导的锌指蛋白，它同时具有泛素连接酶和脱泛素化蛋白活性（dixit et al.,1990;opipari et al.,1990;heyninck et al.,2005）。该蛋白可通过抑制nfкb（核转录因子κb）活性，参与nfкb信号途径，调节先天免疫和获得性免疫，炎症反应，发育，分化和细胞活力（vij et al.,2006）。an1锌指结构最初在爪蟾锌指蛋白an1的c端发现(linnen et al. 1993)，是类泛素融合蛋白，定位于爪蟾卵细胞和早期胚细胞的动物半球，由动物半球1（an1）母源rna编码（rebagliati et al.,1985;linnen et al.,1993）。在同时包含an1和a20结构的锌指蛋白中，目前研究较为深入的有人类awp1(associated with protein kinase c related kinase 1)，人类及老鼠znf216，水稻osisap1蛋白。awp1是被最早鉴定的a20/an1型锌指蛋白，它是通过用人ubiquitin结合酶cdc34作为诱饵，利用酵母双杂交分离得到的。其在人体各种组织中广泛表达，能与ser/thr蛋白激酶prk1专一性相互作用（duan et al.,2000）。而prk1能够与多种参与细胞信号传导的蛋白相互作用，prk1在果蝇中的缺失突变能够导致果蝇发育异常(lu et al.,1999)。人类znf216与人类a20蛋白相似，它也能与免疫反应元件相互作用，参与nfкb激活途径的负调节（vij et al.,2006）。但与a20不同，znf216无论在mrna水平还是蛋白质水平都不受tnf诱导(huang et al.,2004)。最近，znf216被鉴定为一种泛素结合蛋白，可能通过泛素-蛋白酶系统参与蛋白的降解（hishiya et al.,2006）。osisap1是植物中最先被鉴定的a20/an1型锌指蛋白（mukhopadhyay et al.,2004）。它与pvpr3(phaseo-lusvulgaris pathogenesis-related protein)锌指结构的一致性最高，达到79%。osisap1胁迫诱导表达分析表明该基因受冷、盐、干旱、干旱和重金属的诱导。过量表达osisap1能够显著提高烟草的抗旱、耐盐和耐冷性(mukhopadhyay et al.,2004)。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本研究对sap7的组织表达、胁迫诱导表达及其编码蛋白的定位进行了初步探究，为进一步阐明该蛋白的功能提供基础。

内容和拟解决的关键问题：

1. 对sap7的组织表达、胁迫诱导表达进行分析。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1. 组织表达、胁迫诱导表达分析

利用TRIZOL提取总RNA，通过反转录PCR获得cDNA。然后利用Real-time PCR分析

（1）组织表达：取成株期水稻各个组织样品，包括根、茎、叶和穗。

（2）胁迫诱导表达：对3-4叶期水稻幼苗进行各种胁迫处理，包括冷、热、高盐、渗透胁迫、干旱、ABA，然后在处理0，20 min，1 h，3 h，6 h，12 h，24 h时分别取样。

2. 亚细胞定位分析

利用载体pA7，将SAP7与GFP编码框融合，构建PA7-SAP7-GFP载体，转化水稻原生质体细胞，确定该基因编码产物的亚细胞定位情况。

技术路线：见附件

4. 研究创新点

无

5. 研究计划与进展

2013.9-2013.10

1. 培养3-4叶期水稻幼苗，用于各种胁迫处理。

2. 取成株期水稻各个组织样品，用于组织表达分析。