产酶溶杆菌OH11莽草酸途径合成关键基因aroA的克隆与功能分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

产酶溶杆菌（lysobacter enzymogenes) 属于黄单胞科（xanthomonadaceae)、溶杆菌属（lysobacter)，是一种重要的生防细菌（christensen cook, 1978)。该菌gc含量较高，有滑行现象；能产生多种胞外酶，包括几丁质酶、蛋白酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶，能降解不同植物病原菌的细胞壁组分（kobayashi et al., 2005）。该菌对许多植物病原真菌、卵菌、革兰氏阳性细菌以及线虫均具有显著的拮抗作用（palumbo et al., 2003; li et al., 2006; qian et al., 2009）。该菌易于培养、发酵和保存，防效稳定，对环境友好，是一种具有明确应用前景的生防细（zhang et al., 2000; folman et al., 2003）。

除产生丰富的胞外水解酶外，产酶溶杆菌还能合成多种小分子抗菌物质（xie et al., 2012）。hsaf（heat stable antifungal factor）是产酶溶杆菌中新报道的一种结构全新的广谱型抗真菌物质（yu et al., 2007）。同时，该物质对丝状真菌的作用方式也是独特的，即通过抑制真菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长（li et al., 2006）。由于哺乳动物和植物中鞘脂类化合物的组成与丝状真菌差异较大，因此hsaf对人类和植物无害，是一种环境友好的新型抗菌物质。wap-8294a2是产酶溶杆菌合成的一种抗革兰氏阳性细菌的环十二肽类抗生素。该抗生素对人体病原细菌--金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus）具有高效抗菌活性，已在日本进而临床二期，有望近期投入市场，是一种重要的新型医用抗生素。前期工作中，本实验室已经明确了hsaf和wap-8294a2在产酶溶杆菌oh11中的生物合成机制，但其生物合成的调控机制知之甚少。

莽草酸途径广泛存在于植物、细菌、真菌中。该途径由七种酶(aroabcdefg)催化，将底物4-磷酸盐赤藓糖和磷酸烯醇丙酮酸合成终产物分支酸。分支酸是合成一系列芳香族化合物重要前体，包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸、叶酸辅助因子、吩嗪、铁载体和水杨酸等（floss, 1997; herrmann and weaver, 1999; dosselaere and vanderleyden, 2001; van lanen et al., 2008)。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标

拟对莽草酸合成基因簇中关键基因aroa进行突变，结合表型分析，明确莽草酸途径是否在产酶溶杆菌中调控df、hsaf和wap-8294a2的生物合成。在此基础上，进一步阐明该途径是否通过df信号来调控hsaf和wap-8294a2的生物合成。

研究内容

3. 研究的方法与方案

研究方法

采用同源重组的方法敲除产酶溶杆菌oh11中的aroa基因，并通过后期的拮抗实验、抗菌物质的活性测定以及互补实验研究该基因的功能。

实验方案

4. 研究创新点

特色或创新处

1、针对oh11菌株基因组中gc含量高的特点，采用特定的pcr体系；

2、采用无标记基因敲除的方法；

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展

1、2013年4月2013年5月：查阅文献

2、2013年6月2009年7月：构建载体