大豆疫霉无毒效应分子Avr3b与寄主蛋白的互作研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大豆疫霉（phytophthorasojae）引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，每年导致全球十几亿美元的直接经济损失[1]。研究大豆疫霉侵染大豆过程中效应分子的作用机制对于进一步揭示在与寄主互作过程中的病原菌的侵染机制非常重要。

大豆疫霉属是一类营半活体营养的病原卵菌，卵菌与真菌具有相似但不完全相同的侵染过程：卵菌一般产生游动孢子，游动孢子接触到寄主植物表面就会吸附到寄主植物表面并萌发产生附着胞，附着胞进一步产生侵入钉穿透寄主细胞防御系统进入寄主细胞后形成吸器，开始短暂的活体营养阶段，之后不断调控寄主细胞的状态，最终杀死寄主细胞发展到死体营养阶段，从而引起病害。病原卵菌与寄主之间的互作符合基因对基因假说，在共进化过程中，病原卵菌产生了致病力等方面的分化，而同时寄主植物也产生了不同的鉴别寄主，很多效应分子被某些或者大部分寄主识别克服成为无毒效应分子。无毒效应分子是病原菌分泌到寄主细胞内抑制植物的pti和eti，同时又能被寄主抗病基因识别的效应分子称为无毒效应分子（avreffectorgene）[2]。目前研究内容主要集中在无毒效应分子（avr基因）在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究，这些将有助于探索植物病原菌avr基因的起源和进化，明确其在致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，从而对近一步认识和防治卵菌病害具有重要意义。

大豆疫霉基因组中有将近400个rxlr效应分子，研究发现效应分子的rxlrmotif可以与植物细胞膜上的pi3p结合，帮助效应分子进入寄主细胞内。目前的研究已经发现一些效应分子能够在植物细胞内发挥毒性功能，抑制植物的免疫反应，帮助病原菌的侵染,如avr1b等能够进入寄主细胞内，抑制植物的防卫反应，从而促进自身的侵入和扩展。但这些大豆疫霉的效应分子在侵染大豆的过程中如何起作用，研究甚少。本实验室通过对大豆疫霉的169个rxlr效应分子进行高通量的筛选，发现其中93个可以抑制植物的抗病反应，11个效应分子能够直接触发抗病反应，表明多数效应分子都具有抑制植物防卫反应的能力。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：筛选与无毒效应分子互作的寄主蛋白。

研究内容：通过酵母双杂交系统，将已克隆得到的无毒效应分子Avr3b构建在酵母质粒pGBKT7上，载体构建成功后，使用实验室已有的构建在pGADT7上的大豆cDNA文库，使用顺序转化的方法先将pGBKT7：：Avr3b转入到酵母菌株AH109中，在以含有pGBKT7：：Avr3b菌株为受体菌大规模转化文库质粒，通过检测不同的报告基因筛选阳性克隆最终得到互做蛋白的序列。

拟解决的关键问题：将目的基因构建到酵母质粒上。

3. 研究的方法与方案

研究方法：将Avr3b构建在酵母质粒pGBK7上，转入酵母菌株AH109中，获得含有Avr3b基因的菌株，将构建好的大豆cDNA文库质粒转入含有Avr3b的酵母AH109的菌株中,在SD/-Leu/-Trp板上验证转化效率，同时将转化好的酵母菌涂在SD/-His/-Leu/-Trp板上，7天后挑取阳性克隆转移到含有X-αgal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp板上进行筛选，挑取生长正常且变蓝的阳性克隆提酵母质粒，再将所提酵母质粒转入大肠杆菌DH5α，通过PCR的方法验证阳性克隆，提大肠杆菌质粒，通过测序，找到与Avr3b互作的大豆基因序列。

目前本实验室分子克隆与酵母操作相关仪器和试剂齐全，载体的构建技术已经比较成熟，并已构建好高质量的大豆cDNA文库和成熟的酵母筛库体系。

4. 研究创新点

已克隆的大豆疫霉的无毒基因与寄主互做的分子机制研究较少，本实验室容量达到2106的大豆cDNA文库可以有效地筛选大豆与Avr3b互做的蛋白并可能发现新颖的分子机制。

5. 研究计划与进展

1.2013-8-12013-8-30，构建酵母质粒pgbkt7：：avr3b载体。

2,2013-9-12014-1-10，转化大豆文库基因以及筛选。

3.2014-2，测序。