CC与靶标蛋白Mediator互作区段的鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，tswv）隶属于布尼亚病毒科（bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（tospovirus），是该属的典型性代表成员，也是布尼亚病毒科中唯一可以侵染植物的病毒^[1]。番茄斑萎病毒是一种有害生物，因首先在染病番茄上发现而命名。作物因感染该病毒而发生的病害被称为斑萎病。番茄斑萎病毒多在热带、亚热带与温带地区发生危害，其寄主范围很广泛，可侵染番茄、辣椒、莴苣、烟草、大豆、花生等85个属1090种植物^[2]。近年来由于气候变化、人类活动以及农业生产等影响，斑萎病的发生日益严重。至今，番茄斑萎病毒病已广泛分布于世界各地，在欧洲、亚洲、非洲、美洲及大洋洲均有分布记录。据报道，番茄斑萎病毒能够造成80%的花生损失和50%-90%的莴苣死亡，而在法国、西班牙等欧洲国家，番茄斑萎病毒可以对番茄、银莲花和辣椒等造成毁灭性危害，直接造成损失到达100%^[3]。目前番茄斑萎病毒已被列为世界上危害最大的十种植物病毒之一。

我国最早于1944年在成都地区的番茄上发现番茄斑萎病毒，随后在四川、广东、云南、宁夏、北京、山东等地相继发现^[4、5]。近年来该病在我国部分地区的危害逐渐加重，基于对该病毒的危险性评估，我国于2007年将番茄斑萎病毒列为进境植物检疫性有害生物。该病毒主要由西花蓟马以持久增殖方式传毒，西花蓟马为多食性、过渐变态昆虫，寄主范围广泛，是造成斑萎病田间大面积传播的主要媒介昆虫^[6]。番茄斑萎病毒侵染植物后，往往在植物的叶片或果实上形成典型的同心圆环枯斑，病毒在植物上的长期侵染可导致植物的枯死。

利用自然番茄抗病资源和抗病基因是控制番茄斑萎病毒的有效方法，目前研究发现的抗番茄斑萎病毒基因sw-5是在一种秘鲁番茄上鉴定到的显性抗性基因^[7]，该基因定位于番茄9号染色体长臂的端粒区域。sw-5对番茄斑萎病毒的各个生理小种均具有较高水平的广谱抗性，对同属的其他一些病毒也具有抵抗作用。含有该抗病基因的番茄植株可以通过只引起轻微的过敏性反应而限制番茄斑萎病毒在植物体内的传播以达到抗病的效果。此后的研究中发现sw-5基因家族的两个成员，sw-5a和sw-5b，分别编码1245个氨基酸和1246个氨基酸，二者具有高度的同源性。但后续试验表明能够发挥番茄斑萎病毒抗性的只有sw-5b，并不是sw-5a。因此我们主要研究的是sw-5b这个抗性基因的一部分。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：找到cc结构域中与mediator互作的关键区段。

研究内容：早期研究中，通过sw-5b的cc区域与本氏烟的基因组文库进行了酵母筛库实验，发现sw-5b的cc区域与本式烟的mediator可以发生互作。因此我的研究内容主要为鉴定在两者互作过程中与参与了与mediator发生互作的cc的关键区段，找到具体是cc的哪一段参与其中以及它引起的是怎样的互作结果，从而进一步分析cc的结构与功能。

拟解决的关键问题：通过酵母双杂交实验鉴定参与互作的关键区段。

3. 研究的方法与方案

研究方法： 本实验主要通过酵母双杂交实验来找到Sw-5b的CC区域在与Mediator互作时的关键性区段。

技术路线:

实验方案：通过构建一系列含有Sw-5b的CC不同区段的pGBT9载体，与pGADT7-Mediator载体共同转入Y2H Gold酵母菌株，进行酵母双杂交实验，根据在不同营养缺陷类型的培养基上酵母菌的生长情况，分析不同CC区段参与下的互作情况，以找到参与蛋白互作的关键性位点。

可行性分析：前面已经有很多人的实验结果表明抗性基因的CC区域能够与很多蛋白互作，另外也已经通过酵母筛库实验筛选到了一个与CC互作的蛋白Mediator，且实验室也有前人进行过酵母双杂交的工作，具备实验所需的各个条件，所以本研究是可行的。

4. 研究创新点

利用酵母双杂交实验鉴定蛋白互作的关键区段。

5. 研究计划与进展

2017年9月2017年10月：实验思路的整理；实验材料的准备和设计：如构建pgadt7-mediator载体和pgbt9-cc全长以及不同区段的酵母双杂交载体，各类培养基的配制等。

2017年11月2017年12月：进行酵母双杂交共转验证，实验结果的分析讨论。

2018年1月2018年3月：进行实验结果的整理与总结，研究报告的撰写等。