农杆菌介导的大丽轮枝菌突变体库的建立开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究背景在世界各地的棉区中，棉花黄萎病（vercicillium wilt）是一种发生普遍的棉花病害，现已成为影响棉花产量的主要原因之一。

1935年，由于从国外引进斯字棉种，棉花黄萎病传入中国，至今已经八十年，在此期间，平均每年都会爆发棉花黄萎病，爆发程度受气候条件和地理差异的影响[2]。

棉花黄萎病传入我国后，先后在陕西泾阳、山西运城、山东高密和河南安阳等地发生危害，70年代，我国已有12个省市自治区发生过黄萎病，主要分布于黄河流域棉区，90年代以后，黄萎病的发生有加重的趋势，发生范围也日趋扩大，今已扩展到全国各产棉区[4]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标及内容通过农杆菌介导的遗传转化方法建立规模达到1000个转化子的大丽轮枝菌t-dna插入突变体库，为后续大丽轮枝菌微菌核形成及其致病机制的研究奠定基础。

拟解决的关键问题1. 农杆菌-agl-1（含有=1300-cm-hph质粒或3-1质粒）与大丽轮枝菌bp2君主共培养条件下转化效率未知的问题。

2.观察对前期的若干实验步骤进行改良后的实验效果。

3. 研究的方法与方案

研究方法及技术路线利用atmt技术创建大丽轮枝菌bp2的突变体库。

实验方案将agl-1农杆菌与bp2大丽轮枝菌共培养，在乙酰丁香酮（as）的作用下使得农杆菌中的t-dna序列整合到真菌的基因组中，然后利用潮霉素对转化子进行筛选，并最终通过单孢分离培养，获得遗传背景单一的转化子。

可行性分析根据前人的文献以及实验记录表明该实验设计能够有效地利用农杆菌t-dna插入大丽轮枝菌中产生突变体。

4. 研究创新点

在现有阶段的样本步骤当中做了进一步的优化，在提高实验效率的同时保证了所建立突变体的转化效率以及遗传背景的单一性。

5. 研究计划与进展

1.研究计划1.1实验前期进行预实验，以熟悉整个实验流程与周期调控参考，并检验在该实验设定条件下农杆菌介导大丽轮枝菌产生突变体的转化率能否达到在2至3个实验周期循环中建立1000个突变体样本。

1.2在8月20号至10月31号期间为正式试验阶段，主要计划在于根据前期实验的方法产生1000个大丽轮枝菌突变体。

2.预期进展2.1前期实验所设定的条件下（v08df2菌种的转化条件），bp2菌株能够实现高效地农杆菌介导的转化。