1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
全球变暖导致气候变化，包括极端高温，这些变化对作物生产造成了毁灭性的破坏[1,2]。热应激通常会损害光合作用，热量引起的含水量降低会对细胞分裂和生长产生负面影响[3]。植物由于其定植的特性，不能改变其位置以逃避外部环境的热应激，当环境温度升高时，植物细胞需要精确的感知并预测高温所造成的潜在危害。高温会使植物细胞膜超流态化并破坏其结构，会通过影响蛋白质折叠和聚集使其失活，高温还能导致新陈代谢紊乱和活性氧的产生[4]。上述危害会进一步影响植物的光合作用、导致敏感组织尤其是生殖器官坏死，进而影响植物发育、生长、繁殖，最终导致作物产量降低。
原核和真核生物进化出一种高温诱导的信号通路来保护、修复或降低高温对大分子物质造成的损害。当HSR被触发时，植物基因组中有数百个基因存在明显的上调表达现象并积累大量的热激蛋白（heat shock proteins, HSP）[5]，这些HSP中大多数是分子伴侣。在高温造成严重危害之前及时合成HSPs是植物获得耐热性所必需的，本底和获得性耐热是HSPs和其它代谢物共同积累的复杂生物学过程[6]。近年来，大量的研究表明上调表达HSP基因是由于热激转录因子（heat-shocktranscription factors, HSF）被激活并结合到HSP启动子区域，从而激活HSP的表达[7]。此外，植物耐热性也受其它信号通路所调控，例如植物激素水杨酸和脱落酸[8]。近年来，尽管HSR信号通路被广泛的研究，但这些研究并没有形成网络，还有一系列问题有待解决。
水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物．全世界大部分人口以水稻为主食，尤其是亚洲、非洲以及拉丁美洲等一些发展中国家，水稻是社会稳定和经济发
展重要的因素[9]。随着人口急剧增长，提高水稻产量迫在眉睫。水稻产量性状尤其是结实率易受环境条件特别是外界高温的影响，尤其在配子形成和开花期水稻对高温胁迫极度敏感，因此高温会导致水稻花穗不育从而降低其大田产量[9]，随着工业化进程的加速，全球产生了越来越明显的温室效应，使得各水稻生产地区在水稻抽穗开花期或灌浆期经常遭受热害的影响。此外，稻米品质除受自身的遗传因素影响外，还受许多外界环境因子的影响，其中温度是影响稻米品质重要因子之一。一般认为，抽穗至成熟阶段高温会加快灌浆速率。缩短灌浆的持续期。加速植株老化，使子粒的充实度受到影响，导致米粒背部、基部或横断面中部的细胞生长和淀粉的积累减少，子粒光合产物不足。子粒充实度不够，细胞间隙加大，从而使米粒垩白增加，透明度变差。因此进行水稻耐热性的遗传研究及选育耐热品种，对促进水稻生产持续、稳定的发展有重要意义。
对于水稻耐热相关报道很少，因此挖掘水稻耐热相关基因，进一步探究其高温胁迫的机制非常重要。由于高等植物HSR信号通路较为保守，因此拟南芥高温胁迫相关基因在水稻中的同源基因可作为水稻耐热研究的重要候选基因。
| 课题的意义、国内外研究进展、应用前景等（列出主要参考文献） 全球变暖导致气候变化，包括极端高温，这些变化对作物生产造成了毁灭性的破坏[1,2]。热应激通常会损害光合作用，热量引起的含水量降低会对细胞分裂和生长产生负面影响[3]。植物由于其定植的特性，不能改变其位置以逃避外部环境的热应激，当环境温度升高时，植物细胞需要精确的感知并预测高温所造成的潜在危害。高温会使植物细胞膜超流态化并破坏其结构，会通过影响蛋白质折叠和聚集使其失活，高温还能导致新陈代谢紊乱和活性氧的产生[4]。上述危害会进一步影响植物的光合作用、导致敏感组织尤其是生殖器官坏死，进而影响植物发育、生长、繁殖，最终导致作物产量降低。 原核和真核生物进化出一种高温诱导的信号通路来保护、修复或降低高温对大分子物质造成的损害。当HSR被触发时，植物基因组中有数百个基因存在明显的上调表达现象并积累大量的热激蛋白（heat shock proteins, HSP）[5]，这些HSP中大多数是分子伴侣。在高温造成严重危害之前及时合成HSPs是植物获得耐热性所必需的，本底和获得性耐热是HSPs和其它代谢物共同积累的复杂生物学过程[6]。近年来，大量的研究表明上调表达HSP基因是由于热激转录因子（heat-shock transcription factors, HSF）被激活并结合到HSP启动子区域，从而激活HSP的表达[7]。此外，植物耐热性也受其它信号通路所调控，例如植物激素水杨酸和脱落酸[8]。近年来，尽管HSR信号通路被广泛的研究，但这些研究并没有形成网络，还有一系列问题有待解决。 水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物．全世界大部分人口以水稻为主食，尤其是亚洲、非洲以及拉丁美洲等一些发展中国家，水稻是社会稳定和经济发 展重要的因素[9]。随着人口急剧增长，提高水稻产量迫在眉睫。水稻产量性状尤其是结实率易受环境条件特别是外界高温的影响，尤其在配子形成和开花期水稻对高温胁迫极度敏感，因此高温会导致水稻花穗不育从而降低其大田产量[9]，随着工业化进程的加速，全球产生了越来越明显的温室效应，使得各水稻生产地区在水稻抽穗开花期或灌浆期经常遭受热害的影响。此外，稻米品质除受自身的遗传因素影响外，还受许多外界环境因子的影响，其中温度是影响稻米品质重要因子之一。一般认为，抽穗至成熟阶段高温会加快灌浆速率。缩短灌浆的持续期。加速植株老化，使子粒的充实度受到影响，导致米粒背部、基部或横断面中部的细胞生长和淀粉的积累减少，子粒光合产物不足。子粒充实度不够，细胞间隙加大，从而使米粒垩白增加，透明度变差。因此进行水稻耐热性的遗传研究及选育耐热品种，对促进水稻生产持续、稳定的发展有重要意义。 对于水稻耐热相关报道很少，因此挖掘水稻耐热相关基因，进一步探究其高温胁迫的机制非常重要。由于高等植物HSR信号通路较为保守，因此拟南芥高温胁迫相关基因在水稻中的同源基因可作为水稻耐热研究的重要候选基因。 IANs蛋白又称为GIMAP（GTPase of immunity-associated proteins），是GTP结合蛋白家族的成员，它在脊椎动物和高等植物中高度保守[10]。动物中的IANs在免疫系统发育和调控免疫反应等方面起重要作用。首个在植物中被报道的IANs蛋白为拟南芥AIG（AvrRpt2-induced gene），当丁香假单胞菌无毒菌株侵染时，该基因在接种点快速、短暂上调表达并诱发过敏性反应[11]。大多数IAN基因在基因组上成簇存在，例如拟南芥中存在的13个IANs中有12个串联排列于1和4号染色体上。IANs家族蛋白具有保守的AIG1结构域，它由五个作用元件（G1-G5）组成，能够结合GTP。IAN蛋白质定位多样化，它们分别定位于细胞质、内质网、高尔基体和线粒体等[11]。但IAN家族是否参与调控植物免疫反应或其他代谢过程还有待进一步研究，它们在植物中的生物学功能还是空白。
参考文献： [1] Lesk, C. et al. (2016)Influence of extreme weather disasters on global crop production. Nature 529,84–87 [2] Lobell, D.B. et al. (2011)Climate trends and global crop produc[1]tionsince 1980. Science 333, 616–620 [3] Hasanuzzaman, M. et al.(2013) Physiological, biochemical, and molecular mechanisms of heat stresstolerance in plants. Int. J.Mol. Sci. 14, 9643–9684 [4] Bac-Molenaar, J.a. et al.(2015) Genome-wide association mapping of fertility reduction upon heatstress reveals develop[1]mentalstage-specific QTLs in Arabidopsis thaliana. Plant Cell 27, 1857–1874 [5] Wu, X. et al. (2009)Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlingsoverexpressing OsWRKY11 under the control of HSP101 promoter. Plant Cell Rep.28, 21–30 [6] Qu, A-L. et al. (2013)Molecular mechanisms of the plant heat stress response. Biochem. Biophys.Res. Commun. 432, 203–207 [7] Zhong, L. et al. (2013)Chloroplast small heat shock protein HSP21 interacts with plastid nucleoidprotein pTAC5 and is essential for chloroplast development in Arabidopsisunder heat stress. Plant Cell 25, 2925–2943 [8] Suzuki, N. and Mittler, R.(2006) Reactive oxygen species and temperature stresses: a delicate balancebetween signaling and destruction. Physiol. Plant. 126, 45–51 [9] 未来气候变化背景下高温热害对中国水稻产量的可能影响分析[J]. 地球科学进展, 2016, 31(5):515-528. [10] Nitta T, Takahama Y. Thelymphocyte guard-IANs: regula[1]tionof lymphocyte survival by IAN/GIMAP family proteins. Trends Immunol2007;28:58–65. [11] Liu C , Wang T , Zhang W , et al.Computational identification and analysis of immune-associated nucleotidegene family in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Plant Physiology, 2008,165(7):0-787. |
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：通过同源克隆的方法，鉴定水稻（日本晴）中IANs蛋白，并研究其在水稻高温胁迫中的表型变化及功能分析，初步解析水稻IANs参与高温胁迫调控的机制，为培育耐高温水稻品种提供理论依据。
研究内容：通过生物信息学分析鉴定水稻（日本晴）中IANs蛋白，利用水稻遗传转化获得IAN的过表达和敲除突变体（Crispr-cas9技术），并分析转基因植株高温胁迫下的表型，同时结合定量检测水稻不同组织和高温处理下IANs的表达特征以及激光共聚焦观察IANs蛋白亚细胞定位分析。
拟解决的关键问题：通过生物信息学方法在水稻中寻找并研究IANs基因家族是否参与调控水稻的高温胁迫，进一步解析水稻耐高温的分子机制；转基因株系的繁种材料的表型鉴定与亚细胞定位，以期达到性状稳定。3. 研究的方法与方案
研究方法与技术路线：
（1）ians生物学功能研究：水稻日本晴ians蛋白的鉴定 水稻ians过表达和crispr载体的构建过表达或ians突变体转基因水稻植株的获得 转基因株系的繁种 水稻ians相关转基因株系在高温胁迫下表型的鉴定。
（2）ians表达模式分析：检测水稻ians在不同组织中的表达量差异 检测高温处理后水稻ians表达量变化 转基因水稻不同组织gus活性检测。
4. 研究创新点
探究IANs蛋白对水稻耐高温的影响，进一步揭示水稻和拟南芥的温敏机制，为培育耐高温水稻品种提供理论依据。
5. 研究计划与进展
| 2018年4月-2018年10月 （1）分别提取水稻根、茎、叶、叶鞘、幼穗RNA并用Real-time PCR检测OsIAN1和OsIAN2在不同组织中的表达量； （2）分别提取38℃和45℃处理0 h、1 h、3 h、12 h后水稻幼苗RNA并用Real-time PCR检测OsIAN1和OsIAN2高温处理不同时间后表达量的变化； （3）完成水稻IANs过表达载体、与GFP融合过表达载体的构建； （4）完成原生质体转化载体的构建； （5）将所有构建好的过表达和沉默载体转化水稻（日本晴）。 2018年11月-2019年3月 （6）通过基因组PCR和RT-PCR鉴定转基因水稻阳性植株； （7）阳性转基因水稻的繁种； （8）IAN相关转基因水稻耐高温表型鉴定； （9）对实验结果进行整理并撰写论文。 |
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