基于分裂式G-四链体的CRISPR信号输出系统的研究开题报告

1. 研究目的与意义

课题研究现状及发展趋势：近年来，分子生物传感的一个重大突破是免疫分析法的发现，其设计用于检测含有抗体或抗原的各种类型的分子。由罗萨琳·萨斯曼和所罗门伯森在20世纪50年代引入，免疫分析法现被广泛应用于许多应用，包括药物监测，临床诊断学和食物测试。

研究意义和价值：聚类规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关蛋白(Cas)系统的发展已经导致了基因组编辑领域的重大进展。CRISPR广泛存在于细菌和古细菌中，为微生物发挥抗病毒作用，以抵御噬菌体的感染。CRISPR-Cas9系统已成功用于人类细胞培养中的基因组编辑，这是治疗各种遗传性疾病的一个重要步骤。随后，CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13该系统分别于2015年和2016年被发现。不像Cas9，Cas12和Cas13都表现出附带解理行为，这意味着这两种蛋白质在与核酸靶标结合后都能够切割非特异性的单链分子。

2. 研究内容和问题

课题的基本内容：CRISPR-Cas为存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种防御机制，以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA，现广泛应用于基因工程中。CRISPR技术凭借其独特的RNA引导下的核酸酶活性开启了核酸检测的新纪元。CRISPR-Cas蛋白在单链引导RNA（sgRNA）的协助下，与靶标序列互补结合后可激活核酸酶活性，进而对DNA/RNA底物进行降解。得益于高效的核酸酶活性，Cas蛋白对底物的催化降解效率近乎受限于扩散速率，可在短时间内将靶物质信号进行指数级放大，通过结合荧光、电化学等信号输出方式已实现了高灵敏核酸检测。此外，以Cas13a和Cas12a为代表的CRISPR技术依赖于sgRNA与靶序列之间的碱基互补配对，因此具有高度的可编程性和单碱基水平上的分辨率。但是目前基于CRISPR的信号输出多是基于荧光基团标记的底物切割，成本较高。

预计解决的难题：在单链激活模式下，考察不同的G-四链体分裂模式以及不同长度的Link链对信号输出的影响，来实现最优信噪比。

3. 设计方案和技术路线

课题的研究方法：CRISPR-Cas为存在于大多数细菌与所有的古菌中的一种防御机制，以消灭外来的质体或者噬菌体的DNA，现广泛应用于基因工程中。CRISPR技术凭借其独特的RNA引导下的核酸酶活性开启了核酸检测的新纪元。CRISPR-Cas蛋白在单链引导RNA（sgRNA）的协助下，与靶标序列互补结合后可激活核酸酶活性，进而对DNA/RNA底物进行降解。得益于高效的核酸酶活性，Cas蛋白对底物的催化降解效率近乎受限于扩散速率，可在短时间内将靶物质信号进行指数级放大，通过结合荧光、电化学等信号输出方式已实现了高灵敏核酸检测。此外，以Cas13a和Cas12a为代表的CRISPR技术依赖于sgRNA与靶序列之间的碱基互补配对，因此具有高度的可编程性和单碱基水平上的分辨率。但是目前基于CRISPR的信号输出多是基于荧光基团标记的底物切割，成本较高。

技术路线：分裂式G四联体的signal on反应研究—signal on反应条件的优化—设计相应的sgRNA基于splitG4系统激活 Cas12a酶放大荧光信号。

4. 研究的条件和基础

基础条件：本课题实施所在实验室具有DNA纳米技术操作相关的各种仪器设备，能够保证本课题的顺利完成。