长江刀鲚体内菌群PCR-DGGE指纹图谱及多样性比较分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.本课题意义与应用前景：

历史上长江刀鲚(coilia nansus)资源极其丰富，长江中下游最高年产量为1973年的3945t，其中仅长江口就达390t，此后年产量不断下降，1982年虽稍有回升，但仍不及1973年的二分之一，特别是1989年以后，刀鲚幼体受到鳗苗网、深水定置张网等有害渔具的过度捕捞，资源每况愈下，目前已到了岌岌可危的地步。而微生物在刀鲚的生长繁殖过程过扮演着举足轻重的角色。微生物个体微小，结构简单，但数量庞大，种类丰富在生命活动中扮演重要的角色, 对宿主生物体健康、营养和免疫等具有重要作用。本试验通过 pcr-dgge 技术检测刀鲚正态微生物区系组成，对比分析洄游前后刀鲚体内菌群进行多样性，可建立基于机体内优势菌群结构的健康评价技术，探讨长江刀鲚菌群受洄游路径周围环境影响之后的稳定性，将有助于探究刀鲚洄游路径中菌群变化特征及长江刀鲚肠道固有菌群的确定，为肠道细菌的功能提供基础依据及刀鲚养殖专用益生菌的开发奠定了基础。

2.国内外研究进展

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：

以长江刀鲚洄游前幼鱼和洄游后成鱼为对象，通过 pcr-dgge 指纹技术探讨长江刀鲚菌群多样性及受洄游路径周围环境影响之后的稳定性。

研究的内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法：

通过 PCR-DGGE 指纹技术探讨长江刀鲚洄游前与洄游后体内菌群多样性，测定其菌群的丰富度指数、群落多样性、均匀度、优势度，建立其菌群DGGE的指纹识别图谱。

实验方案：

1.1样品采集

本实验样品鱼采集位于长江靖江段，采集时间为：2012年9月随机抽取10尾新鲜幼鱼（洄游前刀鲚），体重为(4.942.57g)，体长（106.214.4mm）；2014年4月采集10尾长江刀鲚成鱼（洄游后刀鲚），体重为(114.5127.91g)，体长（280.163.2mm），同时在刀鲚捕捞处采集水深1.5m左右水样1L，放置于冰上运输至实验室。

1.2样品处理

在超净工作台上处理实验鱼，先用75%酒精喷洒体表、无菌的解剖剪刀分别取出长江刀鲚鳃、胃、肠及肠内容物，将同一批次的采集样品的相同组织合并于-30℃保存备用。

水样处理在超净工作台上操作，用0.22um 的无菌滤膜和真空抽滤装置过滤水样,在无菌条件下将滤膜上的过滤物用无菌水在无菌培养皿中冲洗下来,在12000 r/min离心 5 min，收集沉淀物保存于-30℃。

1.3总DNA提取

所有样品在提取DNA 之前需完全解冻。DNA提取参照Yu等^[13]的方法，并结合传统的CTAB法稍作修改。称取约0.25-0.5 g 样品到灭菌的 2 mL 离心管，加入1 mL 细胞裂解液[1.4M NaCl，2% CTAB，100nM Tric-HCl，50mM EDTA]，20ul20 mg/mL蛋白酶k，20L20mg/mL 溶菌酶，漩涡震荡5min；37℃250r/min摇床振动 1h，加入100L 的20%SDS，漩涡混匀3min，65 ℃水浴40min，13000r/min 4℃离心5 min，将上清吸入2 mL 离心管中；加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽提，12000r/min 离心 5min，取上清；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇重复抽提纯化一次；取上清液加入等体积氯仿∶异戊醇去酚纯化；上清液吸入至新的无菌离心管加入0.6倍体积的异丙醇沉淀，-20℃，放置30min；12,000r/min 离心10 min，弃上清；用70%预冷乙醇洗涤沉淀，无菌风吹干，加适量无菌水溶解DNA。样品各取5LDNA，0.7% 琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4 PCR-DGGE分析

PCR具体扩增引物和条件参考文献^[14]进行。将具有清晰条带 PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析。凝胶浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7 mol/L和40%（v/v）的丙烯酰胺）；变形梯度为35%～55%。电泳条件：60℃，在1TAE缓冲液中150V下电泳10小时。银染步骤参考郁二蒙等^[15]的方法进行。银染后，在Vilber凝胶成像扫描系统中照像，并用BIO-RAD Quantity One 软件对DGGE指纹图谱进行分析，通过Biodap软件对样品泳道灰度值进行分析计算得出一些比较不同样品微生物多样性的基本指标。电泳条带的数量可以代表样品群落的丰富度指数；香农多样性指数(shannondiversity index)反应群落多样性，Evenness 代表样品群落的均匀度；Berger-Parker Index 用来表示优势度^[16,17]。

1.5 DGGE图谱中部分优势条带的回收与测序分析

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，加入30ul无菌水4℃静置过夜。以DNA浸出液为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。PCR扩增体系和程序参考文献^[18]。将有扩增结果为200 bp左右的PCR产物进行TA克隆，并挑选阳性克隆子寄至上海博尚生物技术有限公司进行序列测定，测序结果去载体并NCBI进行BLAST同源性比对分析。

可行性分析：

客观条件：实验材料充足，实验技术方法成熟，实验设备齐全，项目资金充沛，开展过预实验，得出理想的实验结果；主观条件：指导老师研究方向水产微生态，专业为微生物，不仅具有深厚的专业知识、宽广的相关知识，还应具有良好的科学品德、组织协调实际解决问题能力，本人也热爱科学，具有扎实的理论基础和超强的学习能力。因此，此科研课题可行性很高。

技术路线：

样本的采集鱼体菌群的采集---菌群DNA的提取菌群DGGE图谱建立DGGE图谱测序分析

4. 研究创新点

特色与创新之处：

1.首例尝试对洄游前、后的长江刀鲚利用pcr-dgge技术，填补刀鲚功能菌群开发探究空白，丰富益生菌菌群库，以期开发具有刀鲚针对性的益生菌菌群，为刀鲚健康生态养殖提供理论依据和技术保障。

5. 研究计划与进展

研究计划及预期进展：

1.2014.07开题报告；

2.2014.07-2014.12查阅关于鱼类肠道的研究文献，以及刀鲚的特殊性，写好实验方案，准备实验所需的材料以及设备。进入试验阶段；