异育银鲫感染病毒CyHV-2后TLR6组织分布及表达研究开题报告

研究方法：

1、文献资料收集：从网上、书刊、报纸等处查阅大量相关资料，并对其真实性、有效性进行鉴定，筛选出有用的资料，从而确定研究方法；

2、设置实验组和对照组进行对比；

3、对分析数据与结果进行全面的归纳整理，选择最优方案并撰写论文。

技术路线(见附件)

2、实验方案

2.1预实验

（1）取12条鲫鱼，分成两组，一组为实验组，另一组为对照组；

（2）对实验组银鲫攻入含有相同剂量病毒（107pfu/mL）的组织培养液，对照组攻入不携带病毒的同剂量组织培养液。6小时之后取实验组、对照组各两条采样，取脑、脾、肾、肝、鳃，之后每隔6小时采样一次；

（3）按照病毒DNA提取试剂盒步骤提取样品DNA；

（4）以样本DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系dDNTP0.5μL,TaqDNAMix0.5μL,buffer(添加Mg2＋)4μL,上下游引物（CyHV-2F/R）各0.5μL,ddH2O15μL，模板2μL；

（5）确定实验用鱼不含有CyHV-2病毒或其他病原，属于健康鱼体。

2.2正式实验

（1）取48条鲫鱼，分成两组，一组为实验组，另一组为对照组；

（2）对实验组银鲫攻入含有相同剂量病毒（107pfu/mL）的组织培养液，对照组攻入不携带病毒的同剂量组织培养液。分别在6h、9h、12h、24h、36h、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d取样，两组各取两条，取脑、脾、肾、肝、鳃；

（3）按照病毒RNA提取试剂盒步骤提取样品RNA；

（4）测量RNA浓度，在260和280nm处的吸光度；

（5）对RNA进行去gDNA,TotalRNA2μL,5gDNAEraserbuffer2μL,gDNAEraser1μL,超纯水5μL,42℃水浴加热2min，取10μL混合液，与primescriptRTEnzymeMix11μL,RTprimerMix1μL,5primescripbuffer24μL,超纯水4μL配成反转录体系，进行反转录；

（6）以cDNA为模板进行PCR扩增，体系为SYBK10μL,上下游引物（TLR6F/R）各0.5μL,Rox0.5μL,ddH2O6.5μL,模板2μL；

（7）对扩增产物进行荧光定量PCR，反应结束后对数据进行分析；

（8）确定银鲫感染鲤疱疹病毒Ⅱ型后TLR6的组织分布及表达。

4、可行性分析

近年来在病原（细菌、病毒）和宿主相互作用及信号转导方面已有初步的研究，与此同时针对该新发病原CyHV-2流行病学调查已进行了研究，已完成病毒理化特性、检测技术等研究，目前已知病毒入侵宿主后宿主血液指标变化情况及不同地域、不同分离毒株之间毒力变化及分子流行病，为本课题的研究奠定了基础。