猪传染性胃肠炎病毒LY86株N基因的序列分析及其在猪睾丸细胞上的增殖特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1. 课题意义猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis, tge）是由猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine, tgev）引起的一种急性、高度接触性肠道传染性疾病，以引起2周龄以内的仔猪严重腹泻、呕吐、脱水与高死亡率（约为100%）为主要特征[1-3]。

1946年，美国首次报道了tge的发生，我国于1956年首次报道该病，近年来该病与其他疾病（如猪流行性腹泻等）的混合感染有愈演愈烈的趋势，给我国养猪业造成了严重的经济损失[4,5]。

目前，猪传染性胃肠炎尚无特效疗法，主要采取综合防控措施对其进行预防与治疗。

2. 研究的基本内容和问题

1. 研究目标完成对猪传染性胃肠炎病毒（tgev）ly86株在猪睾丸细胞上增殖特性及tgev ly86株n基因遗传进化分析的探究。

2. 研究内容（1）鉴定猪传染性胃肠炎病毒ly86株与猪睾丸细胞；（2）探究猪传染性胃肠炎病毒ly86株在猪睾丸细胞上的增值特性；（3）使用生物信息学软件meg-align对tgev ly86毒株的n基因进行分析，绘制该基因的系统进化树，以揭示该毒株与各参考毒株之间的遗传演化关系。

3. 拟解决的关键问题（1）确定tgev ly86株对st细胞的最佳感染复数（moi）；（2）揭示临床分离株tgev ly86株的遗传演化关系。

3. 研究的方法与方案

1. 研究方法（1）通过细胞培养与形态学观察、细胞致癌与致瘤分析、细胞核型分析等试验对所使用的猪睾丸（st）细胞进行鉴定；（2）通过病毒的细胞培养与形态学观察、病毒的纯净性检测与滴度测定、rt-pcr与测序等试验对tgev临床分离株ly86株进行检测与鉴定；（3）通过生物信息学方法对tgev ly86株的n基因进行遗传进化分析，揭示该分离株与genbank上发表的17个tgev参考毒株之间的遗传演化关系。

2. 技术路线（见附件图）3. 实验方案（1）st细胞的传代培养与形态学观察将st细胞进行常规传代培养，即于无菌条件下吸弃细胞培养液，用无菌的pbs缓冲液洗涤细胞2遍后弃去。

加适量0.25 %胰酶于37℃、5 % co2培养箱中消化细胞，约3 min后弃去大部分胰酶并利用剩余胰酶继续消化1-2 min，轻拍培养液侧壁细胞即脱落。

4. 研究创新点

本研究将使用生物信息学软件MegAlign对临床分离株TGEV LY86株N基因进化分析，从分子遗传学角度揭示该临床分离株的分类地位。

5. 研究计划与进展

（1）2017.09-2017.10完成st细胞的传代与形态学观察、致癌与致瘤性分析、核型分析。

（2）2017.10-2017.11完成tgev ly86株的培养与形态学观察、病毒纯净性与滴度测定。

（3）2017.11-2017.12完成tgev ly86株n基因的rt-pcr与测序。