猪圆环病毒2型Rep基因启动子区GATA位点的生物学特性研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒(pcv)根据基因组和抗原性差异可以分为pcv1和pcv2两种血清型。[1]其中pcv1对猪没有致病性，而pcv2被认为是断奶仔猪多系统衰竭综合征（post wean multi-system wasting syndrome, pwms）的重要病原，可以引起断奶仔猪贫血、黄疸、消瘦、生长发育不良乃至发生衰竭、死亡等症状。此外pcv2的感染还可以引起猪群的免疫抑制，繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒、伪狂犬病毒等病原混合感染和免疫刺激可以加重该病的危害程度。[2]目前pcv2已经成为严重危害我国养猪业发展的主要病原之一，造成巨大的经济损失。[3,4]

pcv2基因组为1767nt或1768nt,主要编码3种功能明确的病毒蛋白。orf1基因可以编码rep、rep两种蛋白成分，并以蛋白复合体的形式参与病毒的复制过程，其间任何基因位点的突变都可能导致病毒的复制无法完成。[5] 位于病毒基因组的互补链上的orf2基因编码的cap蛋白是构成pcv2病毒衣壳的主要结构成分。[6]由于pcv2编码的病毒蛋白数量有限，不能像复杂的病毒那样改变细胞环境以便于自生的复制。所以通常利用其他病原感染宿主造成的有利条件进行增殖或者通过结合侵染细胞内的蛋白或者酶实现自身功能。meerts等研究发现，用一定剂量的猪干扰素处理感染pcv2的pk15细胞，可以增加感染pcv2阳性细胞数量，促进病毒增殖.[7]

前期实验中，我们使用基因测序软件分析pcv2基因组时发现一个类gata-3结合位点。gata-3 转录因子是锌指转录因子gata 家族中的一员，在控制细胞发育中发挥了关键性的作用。[8]gata-3基因编码的gata-3蛋白是一个多功能的转录调节因子，在胚胎期的动物各种组织中大量表达。[9]由此我们推测圆环病毒可能利用宿主细胞中的转录因子或者蛋白成分与其rep 基因启动子区类gata-3位点结合从而调控rep基因表达，影响整个病毒的复制。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标：gata生物学特性的研究

2内容：

luciferase实验：通过构建的pgl3-basic-p193以及pgl3-basic-p193-gatamut转染细胞后最终的luciferase实验值比较

3. 研究的方法与方案

重组质粒的构建及鉴定

PCV2 JN株感染性克隆的构建、病毒拯救及GATA-3位点基因突变病毒的构建

4. 研究创新点

本实验对PCV2 Rep基因启动子区GATA位点进行突变，构建T-PCV2-GATAmut扩增圆环病毒后转染细胞。通过与正常无突变圆环病毒感染后检测到的病毒数量对比，从而研究GATA位点对整个圆环病毒复制功能的影响来研究GATA生物学性状以及相应机制。

5. 研究计划与进展

2015.3-2015.4：进行圆环病毒突变体t-pcv2-gatamut的构建，构建完成后即进行

正常pcv2以及pcv2-gatamut的luciferase实验

2015.4-2015.5： 将正常pcv2以及突变毒株pcv2-gatamut导入到dh5α感受态细胞进行扩增，然后酶切、跑胶分离、胶回收、圆环病毒环化，转染细胞后进行细胞传代并检测最终复制组装的病毒浓度