pmrA/pmrB介导大肠杆菌对多粘菌素E的耐药机制开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌，可导致如腹泻、泌尿道感染、肺炎、败血症、心内膜炎、幼儿脑炎，肉芽肿等多种疾病 ^[1]。抗生素在大肠杆菌病的预防及治疗方面有着不可替代的作用，随着疾病防控过程中抗生素广泛不合理使用，加速了耐药性的发展，目前耐药性已十分严重。虽然新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的产生速度 ^[2-3]，直接给中国畜牧业带来严重的损失。

多粘菌素e 对革兰氏阴性菌及泛耐药引起的感染有较强作用，特别对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类药物产生耐药的革兰氏阴性菌引起的感染有效^[4-5]。20世纪60 至70年代，多粘菌素用于治疗革兰阴性菌所致的全身多位点感染曾由于肌注可引起局部剧烈疼痛，对肾脏和神经系统有明显毒性作用被弃用，近年来，由于多药耐药大肠杆菌感染广泛流行，后续又缺乏有效的抗生素，多粘菌素类又被应用于临床^[6-8]。但是目前临床分离革兰氏阴性菌对多粘菌素Ｅ的耐药性也不断上那个，尤其鲍曼不动杆菌、克雷伯肺炎杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌对其耐压性也在不断上升^[9]_。

基于国内外目前对大肠杆菌耐药机制的研究现状，借鉴同源性高的其他菌如鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌等的研究成果，充分论证该研究的可行性后，本实验以临床分离的对多粘菌素耐药的6株大肠杆菌为研究对象，通过构建pmra和pmrb基因缺失株，明确这两个耐药基因各自在多粘菌素类抗生素耐药中的作用，进一步为大肠杆菌耐药性的分子流行病学调查和发掘新的药物靶位提供探索途径；从而更好地理解细菌耐药性的发生机制和传播规律,进而探索阻遏细菌耐药性上升趋势的更合理策略。

2. 研究的基本内容和问题

通过本实验室多年来对大肠杆菌耐药机制的研究，从中筛选出对多粘菌素耐药的大肠杆菌并诱导耐药，从而获得耐药株。PmrA/ PmrB是大肠杆菌体内介导多粘菌素耐药的二元调控系统，同时存在于同一菌株中，但这两个基因在大肠杆菌对多粘菌素类抗生素耐药中有何作用及相互之间有何联系仍不清楚。基于以上的工作假说，我们拟构建PmrA/PmrB基因突变株，明确这两个基因在大肠杆菌对多粘菌素类抗生素耐药中的作用。

细菌产生耐药性后能否在宿主和各种环境中生存，是否会与其敏感菌发生竞争性排斥，是否能够很快适应环境，成为优势菌群从而引起耐药菌的广泛传播等相关问题，这些问题决定了耐药菌在宿主和环境中的存在、释放和扩散。如果耐药大肠杆菌的适应性的得到加强，表现出比敏感菌更佳的适应能力，机体内的耐药菌将会大量繁殖从而加大治疗的难度。基于以上工作假说我们以实验室现存的多粘菌素类耐药大肠杆菌菌株为研究对象，通过测定菌株的生长曲线以及竞争曲线分析评价临床分离的多粘菌素类耐药菌株的适应性代价。

3. 研究的方法与方案

1.大肠杆菌中pmra耐药基因的检测

设计pmra基因的引物优化pcr条件，体外诱导耐药菌体该基因。

2. pmra/pmrb突变位点检测

4. 研究创新点

实验以大肠杆菌对多粘菌素耐药的大肠杆菌为研究对象，通过构建PmrA基因缺失株，明确这两个耐药基因各自在多粘菌素类抗生素耐药中的作用，进一步为大肠杆菌耐药性的分子流行病学调查和发掘新的药物靶位提供探索途径；从而更好地理解细菌耐药性的发生机制和传播规律,进而探索阻遏细菌耐药性上升趋势的更合理策略。

5. 研究计划与进展

2015.3．2-2015.3.30 查找相关文献，学习相关试验技能，制定试验计划。准备仪器试剂，撰写开题报告。

2015.4.1 -2015.4.15多粘菌素对大肠杆菌mic的测定。

2015.4.16 -2015.4.25 pmra/pmrb突变位点的检测，测定mrna表达水平

2015.4. 26 -2015.5.12构建pmra/pmrb突变株，测定其对mic的影响