山羊副流感病毒3型JS2013株F蛋白的真核表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

山羊副流感病毒是副黏病毒家族中的一个新发现的成员。

2013年下半年至2014年3月，江苏多地育肥羊出现呼吸道症状为主的疾病，本实验室采集不同发病场鼻拭子和血清样品，检测呼吸道相关病原，在大部分样品中检测到副流感病毒3型。

将阳性病料接种于mdbk细胞，连续传代5代，经rt-pcr和血凝试验检测证实分离到病毒，命名为js2013。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：本研究目的是采用bac-to-bac杆状病毒表达系统构建表达山羊副流感病毒3型js2013株f蛋白的重组杆状病毒,通过感染sf9细胞获得体外表达的f蛋白,为进一步研究f 蛋白的功能及新型疫苗的开发奠定基础。

内容：设计引物，rt-pcr扩增山羊副流感病毒3型js2013株f蛋白全基因，通过酶切克隆入pfastbachtb中，将阳性重组质粒转化dh10bac，经蓝白菌落筛选，挑取白色菌落提取重组穿梭质粒bac-f，经pcr鉴定，将正确重组的bac转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒，并鉴定蛋白表达情况。

拟解决的关键问题：获得目的基因；获得重组杆状病毒；鉴定蛋白的表达

3. 研究的方法与方案

1.1基因扩增：设计合成引物，以提取的cpiv3 rna为模板，加入设计引物进行f基因的扩增。

pcr产物的纯化，pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖块,用dna快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。

1.2重组供体质粒的构建和鉴定：将 hn和pfastbachtb载体进行双酶切，电泳并切胶回收酶切产物。

4. 研究创新点

1. bac-to-bac系统由供体质粒和大肠杆菌dh10bac组成，dh10bac 中包括bac 和辅助质粒。

bac 既可以在大肠杆菌中低拷贝复制，也可以在昆虫细胞中复制、表达、形成子代病毒。

该系统在大肠杆菌中完成同源重组，重组率高，筛选操作简单，不需进行空斑纯化，只需7～10 d 即可获得重组病毒。

5. 研究计划与进展

1.7-3.2 熟悉课题内容收集资料3.2-3.31 引物的设计和合成，重组供体质粒的构建与鉴定4.1-5.10重组杆状病毒的构建和鉴定5.11-5.20整理试验数据准备论