猪圆环病毒2型单克隆抗体的制备与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒（porcine circovirus, pcv）根据其血清学特性和进化关系的不同，分为pcv1和pcv2两个亚型^[1]，其中pcv1在猪体内普遍存在，致病性较低^[2]，而pcv2相关的各类疾病给猪场造成了日渐加剧的危害，已经成为研究人员急需解决的问题之一，这些疾病被统称为猪圆环病毒病(porcine circovirus, pcvd)或猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus-associated disease, pcvad）^[3],其中断奶仔猪多系统衰竭综合征（post-weaning multisystemic wasting syndrome, pmws）给全世界养猪业带来了巨大的经济损失，血清学调查表明，pcv2在断乳猪和育肥猪中广泛存在，临床上易与其他病原混合感染，出现各种临床症状，是导致pmws的主要原因。随着近年研究的深入，有关病毒的致病机理、基因特征的研究也逐渐有所突破。

pcv感染会干扰正常的免疫功能，mcneilly等在研究pcv感染猪肺泡巨噬细胞体外免疫功能的影响中，发现fc和补体受体或者吞噬作用没有影响。在感染后4d对mhc-1类抗原有上调作用，8d后降低了细胞对mhc-2类抗原的表达。患pmws的猪在由病毒或免疫刺激分子作用下其免疫功能下降，另外pcv2能够改变健康猪和患pmws猪外周血单核细胞的功能。pmws的猪，淋巴结、淋巴滤泡及滤泡间质区大量的巨噬细胞浸润，淋巴组织中细胞类型减少，t细胞、b细胞的循环量降低，外周血和淋巴组织中单核细胞减少，一过性的pmws猪不出现有效免疫应答。另外，pmws患猪的淋巴组织做免疫组化和用终末端脱氧核普酸转移酶介导脱氧三磷酸脲苷缺口末端标记法，检测细胞增生、凋亡，初期淋巴细胞及骨髓样细胞增生降低，中期及后期增生无变化，细胞的流通量从初期到后期显著下降，可能是由于淋巴细胞增生降低而凋亡不增加导致淋巴细胞耗损的最重要可变因素^[4]。

pcv2为无囊膜，单股环状的dna病毒，核衣壳二十面体对称，各毒株之间的核苷酸同源性大于96%，形成一个组，其基因组全长为1766bp^[5],1767bp或1768bp^[6]，与pcv1相比，在基因组的不同的部位存在小段的缺失和插入，目前证明病毒基因组主要含有4个开放性阅读框，orf1_~4^[7~8]，orf1编码病毒复制所需的相关蛋白^[9]，orf3和orf4编码的蛋白与病毒引起的细胞凋亡有关^[8，10],orf2编码病毒的核衣壳蛋白，即cap蛋白。cap蛋白是病毒的主要结构蛋白，大小约30kda^[11]，该蛋白是pcv2的主要免疫原^[12]，与宿主免疫有关，且pcv1与pcv2之间不存在抗原交叉反应^[13]，在流行病学诊断及疫苗学研究中占有重要地位，因此该蛋白是pcv2的研究热点。

2. 研究的基本内容和问题

本研究旨在对3E5、5H7单克隆抗体进行制备和鉴定，通过对小鼠置腹水的方式制备单克隆抗体，并采用多种方法对其鉴定，为进行该病毒抗原表位分析、致病极力、鉴别诊断等方面的研究奠定基础。

3. 研究的方法与方案

研究方法

通过各种实验室技术如腹水制备、western blotting、elisa鉴定、中和活性测定等方法完成单克隆抗体的制备及鉴定过程。

技术路线

4. 研究创新点

1. 使用多种方法对单克隆抗体进行鉴定

2. 纯化的pcv2病毒粒子直接作为免疫原，保留了病毒本身cap蛋白的天然结构，相较于原核表达的cap蛋白，具有更好和更完整的免疫原性

3. 同时做两种细胞的单克隆抗体，可比较分析

5. 研究计划与进展

四月中旬之前，熟练掌握并完成杂交瘤细胞的复苏和单克隆抗体腹水制备的技术；中期之后，用ELISA检测法、Western blot、中和活性测定等方法对单克隆抗体进行检测