犬瘟热病毒感染vero细胞的差异蛋白质组分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

课题意义：犬瘟热（canine distemper,cd）是世界范围内广泛发生的一种病毒性传染病，其病原为犬瘟热病毒（canine distemper virus,cdv），隶属于副黏病毒科麻疹病毒属，其自然宿主包括大部分的食肉目动物。

虽然犬瘟热病毒疫苗对该病毒有较好的预防作用，但是今年来该病的流行性爆发提示其发病机制亦可能存在新的变。

cdv的淋巴细胞趋向性和其引起的高度免疫抑制,国内外学者已做了大量研究,但其致病机理及免疫机制至今尚未明确,有待进一步研究。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本实验拟使用lc-ms/ms（shotgun）的方法，对犬瘟热病毒感染的vero细胞与未感染细胞进行蛋白质组差异分析，目的在于初步的定性的发现感染与未感染细胞间的蛋白质组表达的差异，由于细胞蛋白的复杂性，进一步对鉴定出的大量蛋白质进行分类与查询并使用生物信息学方法对该差异进行分析，为阐明其致病机理提供理论依据。

研究内容：1. 犬瘟热病毒感染vero细胞及其阴性对照细胞的培养和构建；2. 细胞蛋白的提取及定量；3. 蛋白样品的初步质量鉴定：sds page 电泳；4. 蛋白样品的fasp (filter aided sample preparation) 酶解5. 反向液相色谱分离样品肽段；6. 样品肽段的q-exative质谱鉴定；7. q-exative质谱数据分析；8. 对差异蛋白进行比较分析，差异蛋白进行生物信息学分析。

拟解决的关键问题：1. 细胞蛋白的提取处理，如何保证蛋白质提取的质量和数量；2. 提取蛋白质的酶切处理，如何保证酶切位点的准确及酶解的效率；3. 如何选择合适的液相色谱条件来对酶解肽段进行色谱分离；4. 接驳液相色谱的质谱仪如何设定参数以适用于实验目的5. 差异蛋白的分析，如何选择合适的软件及检索库；6. 生物信息学分析，如何选择合适的软件及检索库。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析研究方法： shotgun技术。

蛋白质全谱分析指的是组分分析，研究对象是完整的组织，体液或其提取物，其目的在于鉴定出尽可能多的肽和蛋白分子。

实验时将溶液内蛋白质分子或sds-page条带的复杂混合物酶解成肽段混合物，通过液相色谱分离，如2d-lc（阳离子组scx和 c18反相柱串联）或1d-lc的c18反相柱，串联质谱测试，最后用相应的数据库进行检索匹配，可同时鉴定成百上千种蛋白质。

4. 研究创新点

vero作为一种对许多人类和动物病毒高度易感的细胞系，被广泛的应用于病毒的分离与培养，之前已有研究者做过vero膜蛋白的质谱鉴定，但是还未有感染犬瘟热病毒的全细胞蛋白质组的分析报告出现。

目前犬瘟热的感染机理还不是很明确，单纯的蛋白分析不能全面的分析出细胞在感染病毒之后的变化，本实验通过细胞蛋白质组的鉴定分析，不仅会发现其中的单个差异，更会在蛋白组群或者相关功能蛋白群发现变化。

shotgun技术是基于质谱的高通量蛋白质组鉴定技术，相对以往的基于凝胶的双向电泳技术有较大的优势，可以得到双向电泳技术不能获得的分子量极大极小、极酸极碱、表达丰度较低以及疏水性蛋白，更加完整和真实的揭示样品中蛋白表达的情况，从而使蛋白质组学研究获得更加满意的结果。

5. 研究计划与进展

1. 2015.3.2-2015.3.20：文献查寻及基础知识的学习2. 2015.3.20-2015.4.15：犬瘟热感染vero细胞的培养工作3. 2015.4.15-2015.5.15细胞蛋白的分离及提纯，样品肽段的制备，样品LC-MS/MS的仪器分析，结果的生物信息学分析及差异蛋白的分析4. 2015.5.15之后：毕业论文的撰写和修改