马链球菌兽疫亚种链激酶的基因敲除及原核表达开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪链球菌病（swinestreptococcosis）是一种常见的猪传染病，世界各国均有发生，危害严重，也是一直困扰我国养猪业的重要传染病之一。该病是链球菌属中多种链球菌引致的猪的一种传染性疫病的总称，其临床表现主要包括猪败血性链球菌病和猪淋巴结脓肿,其主要特征是败血症、化脓性淋巴结炎、脑膜炎以及关节炎,其中以败血症的危害最大,在某些特定诱因作用下,发病猪群的死亡率可以达到80%。[1,2,3]。在我国，马链球菌兽疫亚种（streptococcusequisubsp.zooepidemicus,sez）也是猪链球菌病的主要病原，其感染症状和猪链球菌相似。

马链球菌兽疫亚种、马链球菌马亚种（streptococcusequissp.equi）和马链球菌类马亚种（streptococcusequissp.equisimilis）是马链球菌（streptococcusequi）的三个亚种，为兰氏分群中的c群链球菌。其中，兽疫亚种和马亚种为马属动物临床上分离频率最高的病原菌[4]，引起马腺疫和马的上呼吸道感染[5,6]。马亚种有着严格的宿主专嗜性，而兽疫亚种能够感染马、牛、猪、犬、羊等多种动物[7,8,9,10,11]。在我国，sez是猪链球菌病的主要病原之一，引起猪的败血症、脑膜炎、心内膜炎以及关节炎等，给集约化养猪业造成巨大的经济损失[12,13]。

链激酶（streptokinase,sk）是由a、c、g群链球菌中β-溶血性链球菌分泌的胞外非酶蛋白质，能和纤维酶原结合，将纤维酶原激活为纤溶酶。boyle等证实病原菌感染后，纤溶酶能溶解感染部位的纤维蛋白，通过水解胞外的基质蛋白，如（层）粘连蛋白、纤维结合素，通过激活潜在的蚀原酶以及其它的血浆酶原如金属蛋白酶原，从而使机体组织更容易被侵袭，有利于病原菌在体内扩散。mccoy等研究证实，非人源的c群链球菌如马链球菌兽疫亚种可产生链激酶，该酶能优先激活该菌的宿主动物体内的纤维蛋白溶酶原，且能结合不同来源的纤维蛋白溶酶原[14]。本实验表达链激酶蛋白以研究该蛋白的特性和作用，构建链激酶缺失株与野毒株做比较分析，确定其对于细菌致病性的作用并为新型药物、疫苗的研发做铺垫。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：通过对链激酶基因的原核表达，可以为进一步研究该蛋白的结构、生理生化作用。对链激酶基因缺失株的构建，可以为进一步的细胞实验、动物实验，完成与野生株的对比，研究其对于细菌致病性的作用打下良好基础

研究内容：1.马链球菌atcc35246中链激酶蛋白的原核表达

2.马链球菌atcc35246中链激酶基因缺失株的构建

3. 研究的方法与方案

实验方案：1.原核表达：

⑴目的片段扩增,双酶切

⑵将目的片段连接到质粒pet-28a,构建重组质粒

4. 研究创新点

关于马链球菌兽疫亚种研究相对较少。然而马链球菌能引起多种动物患病，人与患病动物接触也可能会导致侵袭性感染如脑膜炎，败血症等，我国已有大规模爆发的先例，造成重大经济损失。

链激酶是马链球菌兽疫亚种的重要致病因子，该酶能结合并激活宿主体内的纤维蛋白溶酶原，并激活胶原酶原在内的多种腐蚀酶，降解纤维蛋白和一些细胞外基质蛋白如层粘连蛋白和纤连蛋白，利用宿主自身的纤溶系统来突破组织屏障、加速对宿主的入侵及在其内迁移，造成全身感染等。通过研究该蛋白的生物学，同时构建链激酶缺失株与野毒株，并做比较分析，探索其在细菌致病过程中的作用并为新型药物、疫苗的研发做铺垫。

5. 研究计划与进展

2015.3.2-2015.3.12收集资料，了解背景，完成实验方案的设计和方法的熟悉

2015.3.13-2015.4.10完成链激酶蛋白表达载体和缺失载体的构建

2015.4.11-4.22完成链激酶蛋白的诱导表达以及蛋白的纯化