1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
意义：囊胚是卵子受精后经卵裂形成，具有内细胞团、外滋养层细胞以及囊胚腔而形成的胚胎。在子宫内的一个特殊环境例如子宫内膜，合适的激素水平等使囊胚能够着床发育，但因为体外培养缺乏这些模拟子宫内的这些条件因而囊胚在体外的继续培养很难实现。目前对孵化后囊胚的研究主要通过胚胎移植到受体，依据妊娠情况来判断其发育能力。而囊胚孵化后的体外培养已经证明牛胚胎能够在体外环境下生长到16天，可以达到内胚层的建立和滋养层的脱落。但由于猪的囊胚体外孵化效率低，即使能够体外孵化，之后胚胎较脆弱很容易凋亡，故猪胚胎孵化后的体外培养方法还未被建立。故研究囊胚的体内的发育情况只能通过宰杀受精后母猪的方式，相对来说非常麻烦。因此若找到合适的囊胚体外培养方式不仅可以解决直接宰杀活猪的问题，也能进一步让人们在体外继续研究观察囊胚的生长发育机制。
卵母细胞通过体外受精、孤雌激活或体细胞核移植等方法可重构成胚胎，第5到7天能发育成囊胚，并从第七天开始陆续孵化出透明带，在体内孵化的胚胎会在第13天到14天时会在子宫中附植。但在体外，猪胚胎的孵化效率一直很低，原因是因为猪胚胎对体外环境较为敏感，对体外培养的条件要求较高。因此，为了更好的研究孵化后猪胚胎的发育机制，非常需要建立一种猪囊胚孵化后的体外培养方法。
国内外研究情况：国内外对囊胚孵化后的培养也多有研究，目前的已知尝试过的猪囊胚孵化体外培养方法有序贯培养（sequantial culture system）、单一培养基培养法、胚胎与子宫内膜细胞共培养体系、建立一个三维凝胶体系（three-dimensional gel system）的方法。首先，序贯培养是目前较为常用技术，应用于体外受精-胚胎移植可较显著的提高胚胎种植率。序贯培养的原理即为胚胎在不同时期发育所需要的营养成分等不断的更换合适的培养液，进行序列更换继而延长胚胎体外培养时间，促进胚胎的生长发育，最后使胚胎发育到8细胞期。有研究表明[1]，小鼠的早期胚胎经过序贯培养之后，可获得较高的囊胚率，且可获得较多的具有的发育潜能较高的胚胎。序贯培养需要配合胚胎发育不同时期提供合适培养液，因此涉及到的培养液种类也较多，培养液的种类及特性可能也会对胚胎发育造成一定的影响。其次，胚胎与子宫内膜细胞共培养体系，张彧等[2]的实验中，将体外受精或通过孤雌激活获得的牛的囊胚与经过原代培养及传代培养的子宫内膜细胞共培养后，观察发现牛囊胚腔扩大且某些囊胚出现了贴壁现象。为了提高胚胎的着床率而建立的胚胎与子宫内膜细胞共培养体系，可通过检测子宫内膜细胞的inf-τ下游信息的表达来鉴定胚胎的着床能力。inf-τ为多基因编码的干扰素，作用是能够阻止体内黄体溶解，在体外使用能使子宫内膜细胞原代细胞表达出子宫源性蛋白 [3-5]，因此胚胎的着床率可以通过测定inf-τ的表达量。建立三维凝胶体系（three-dimensional gel system）可以支持牛囊胚的发育及分化，该体系中的琼脂凝胶隧道采用添加10%胎牛血清与3g/ld-葡萄糖的培养基，从而促进囊胚的体外伸长，快速生长和分化。有研究表明，在体外建立一个三维凝胶体系体外培养牛囊胚，可以有效的促进牛囊胚的快速生长及伸长[6]。该研究通过将体内产生的牛胚胎置于琼脂糖凝胶通道中进行体外培养，观察发现获得的胚胎在不断的伸长并在培养的第16天时获得最大伸长长度。之后vajta等人[7]对该研究进行了更深层次的拓展并报告了进一步的进展，在琼脂凝胶隧道内培养的胚胎在长期培养至第26天时，不仅具有较高的伸长率，而且具有较高的成活率，发育潜能也较高，具有初步的分化迹象。然而在一项研究中[8]发现利用三维凝胶体系培养出来的囊胚虽然出现了囊胚的伸长但却并未出现条纹1期胎盘，且将该体系应用于猪囊胚发育难度与牛相比会更高，原因可能是猪胚胎对体外情况的敏感性较高或对其生长和分化所需因素的了解不够完善等。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：该实验主要研究建立一个猪囊胚体外培养体系，以期该体系可减小体外培养对胚胎的损害从而提高囊胚体外培养的存活率。为胚胎的体外培养提供新的思路和参考。
研究内容：研究建立的猪囊胚体外培养体系是否能够提高囊胚的存活率。
拟解决的关键问题：实验中使用的培养液等是否会损害胚胎降低存活率。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
一、采集卵母细胞并培养到mii期
卵巢用37℃的生理盐水加青霉素和链霉素的混合溶液清洗干净，用10ml的注射器抽取卵巢表面卵泡的卵泡液和卵母细胞，静置5min，之后将形状状态良好的活的卵母细胞在显微镜下捡出，用pbs洗两次，之后放入ivm中在细胞培养箱中培养42~44h。
4. 研究创新点
本实验提供了一种猪囊胚孵化后的培养体系，为体外研究猪囊胚孵化后的发育情况提供一种可能。
5. 研究计划与进展
研究计划：
2018.8 撰写文献综述
2018.9-2019.4 进行实验，解决实验问题，记录每次实验后胚胎的发育情况例如孵化后胚胎的存活率，胚胎的直径等。
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