The construction of Split-Sfp system开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

在一切生命体中，生物大分子的相互作用，特别是蛋白-蛋白相互作用主导着生命活动。

一个简单易用、灵敏度高的研究蛋白互作的工具必定具有广泛的应用范围和巨大的应用价值。

在研究生物大分子互作的众多的研究方法和工具中，分裂蛋白重组装系统（split-protein reassembly）应用最为广泛。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：本研究将在idgs-sfp报告基因系统基础之上，构建一个全新的分裂蛋白重组装系统。

研究内容：idgs-sfp 报告系统的建立（e.coli）根据sfp结构预测可能的切割位点circular permutation 验证切割位点的可行性，筛选出潜在的切割位点。

④分别融合已知的互作蛋白，进一步验证上述筛选到的切割位点拟解决的问题：逐一检验各潜在切割位点，确定sfp蛋白的最优切割位点，最终构建基于 sfp的分裂蛋白重组装系统；并测试该系统用于蛋白-蛋白互作研究的可行性。

3. 研究的方法与方案

研究方法： 该系统的建立均基于大肠杆菌表达系统，通过puc19等质粒作为载体进行构建，底物l-谷氨酰胺存在于所有细胞内，故经已构建载体转化大肠杆菌后的表型来鉴定sfp是否恢复功能。

具体方法如下图所示：技术路线： 试验可行性分析基于实验室具备的条件，可顺利完成各项构建。

idgs-sfp报告系统已构建完成，证实完整的sfp蛋白可与idgs作用改变大肠杆菌表型为蓝色，sfp具有报告蛋白的性质。

4. 研究创新点

该报告系统的建立，克服了现有的一些报告系统的一些缺点，在基于idgs的Sfp分裂蛋白重组装系统中，无需添加外源的底物、无需特殊的仪器，凭借大肠杆菌的表型即可判断蛋白是否互作；大大节省了时间，经过分子生物学基因克隆基本手段，操作简单；Sfp仅由224个氨基酸构成，比绿色荧光蛋白GFP分子量更小，更易操作；不仅可用于蛋白互作研究，还可用于DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等小分子之间相互作用的研究。

5. 研究计划与进展

2015.05~2015.06：idgS-sfp 报告系统的建立（E.coli）； 2015.06~2015.07：根据Sfp结构预测可能的切割位点； 2015.07~2015.10：Circular permutation 验证切割位点的可行性，筛选出潜在的切割位点； 2015.10~2015.12分别融合已知的互作蛋白，进一步验证上述筛选到的切割位点； 2015.12-2016.01 通过由雷帕霉素介导的小分子蛋白互作检测SFP各切割位点作为片段化互补的可行性。