2016~2017年间中国部分地区猪圆环病毒3型的分子流行病学研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪圆环病毒（porcine circovirus，pcv）属于圆环病毒科、圆环病毒属，为单链、环状 dna 病毒，无囊膜，呈二十面体对称，病毒粒子平均直径17nm，是目前已知最小的动物病毒之一。

2016年之前，全球范围内仅发现pcv1和pcv2两种基因型。

pcv1无致病性，而pcv2是造成猪圆环病毒相关病（porcine circovirus associated disease，pcvad）的重要病原，pcvad包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，pdns）、猪呼吸道病、肠炎、母猪繁殖障碍和仔猪先天性震颤等[1]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：了解pcv3 在我国中东部地区规模化猪场的分布与流行情况，探明其分子流行病学特征，发现其优势流行毒株。

研究内容：采用实时定量pcr（real-time quantitative pcr，qpcr）或pcr技术对2016-2018年间收集自中东部地区多个规模化猪场的可疑样品进行pcv3检测，对阳性样品的核酸进行pcv3全基因组测序以及基因序列比对分析，构建遗传进化树。

拟解决的关键问题： 通过检测样本中pcv3的阳性率，了解pcv3在我国中东部地区的感染及分布情况；通过对阳性样本的pcv3全基因组测序分析，并进行基因同源性比对和遗传进化分析，初步探究我国中东部地区pcv3的进化情况，为我国pcv3相关疾病的防控提供理论依据。

3. 研究的方法与方案

研究方法：利用qpcr技术检测pcv3，利用pcr技术扩增pcv3基因组，全基因组测序，用基因分析相关软件进行基因比对及进化树构建，进行遗传变异分析和基因分型。

技术路线： 病料采集→pcv3检测→pcv3基因组扩增→全基因组测序→基因比对、进化树构建实验方案：1. 病料采集及样本处理采集规模化猪场临床表现繁殖障碍和呼吸道疾病的病猪的肺、脾、淋巴结、流产胎儿组织、粪便、唾液、血液等，-80℃保存备用；取适量病料，剪碎放入2ml ep管，加约1ml灭菌的pbs，研磨机研磨，-80℃反复冻融3次；12000rpm离心10min，取上清。

2. pcv3检测引物及基因组全长扩增引物的设计及合成检测引物的序列参考palinski 等建立的pcv3 qpcr检测方法：探针5′6-羧基荧光素acc cca tggzenctc aac aca tat gac ciowa black3′，上游引物5′agt gct ccc cat tga acg3′，下游引物5′aca cag ccg tta ctt cac3′，反应条件为95c 10min，95c 10s、60c 60s扩增40个循环。

4. 研究创新点

PCV3是2016年首次报道的猪源致病病毒，在我国的流行、分布及致病情况报道较少，本研究探究PCV3在我国的感染及流行情况为PCV3相关疾病的研究提供了及时的理论基础。

5. 研究计划与进展

2018年3月5日-2018年4月15日：对可疑样品进行PCV3核酸检测；2018年4月16日-2018年4月30日：PCV3阳性样本PCV3全基因组扩增及测序；2018年5月：完成PCV3全基因组、Cap基因和Cap蛋白氨基酸序列比对和进化树构建。