猪链球菌2型丝氨酸蛋白酶的原核表达及其多克隆抗体的制备开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

猪链球菌(streptococcus suis, ss)是一种重要的人兽共患病原菌，根据荚膜多糖抗原性的差异，分为35个血清型，其中2 型 ( streptococcus suis type 2 , ss2) 最为常见、毒力最强、危害最严重。

不仅可以引起猪的败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡。

1998年江苏和2005年四川暴发了由ss2引致的人及猪的链球菌病，引起了全世界的关注[1]。

2. 研究的基本内容和问题

研究的目标：利用大肠杆菌原核表达猪链球菌2型丝氨酸蛋白酶，制备多克隆抗体。

研究内容：1.pcr扩增ss2强毒株ss2-1的丝氨酸蛋白酶编码基因；2.克隆到原核表达载体pet28a，构建重组表达质粒；3.在bl21（de3）中表达重组蛋白，并纯化重组蛋白；4．免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体；5.进行丝氨酸蛋白酶的功能验证。

拟解决的关键问题：构建重组表达质粒，纯化重组蛋白，并制备多克隆抗体。

3. 研究的方法与方案

研究方法：1.PCR扩增丝氨酸蛋白酶基因；2.构建重组表达质粒； 3.纯化重组蛋白方法； 4.多抗血清的制备及滴度检测； 5.蛋白功能验证技术路线：前期准备：引物的设计及合成↓PCR扩增目的基因↓构建原核表达质粒↓诱导表达重组蛋白，重组蛋白纯化↓制备多克隆抗体，ELISA检测抗体效价↓丝氨酸蛋白酶功能试验实验方案：1. PCR扩增目的基因，纯化PCR产物，连接pMD18-T转化至感受态DH5α，用试剂盒提取质粒，酶切，电泳鉴定；2.目的基因连接到表达载体pET28a, 转化至感受态细胞BL21，3.诱导表达重组蛋白，亲和层析法纯化重组蛋白；4.重组蛋白和弗式完全佐剂乳化，免疫注射新西兰白兔，免疫程序后采血分离血清，ELISA方法测定抗体效价；5.丝氨酸蛋白酶功能试验。

可行性分析：1.试验技术比较成熟，无技术难度；2.实习实验室具备试验所需仪器；3.工作时间有保证

4. 研究创新点

蛋白酶是细菌的重要毒力因子，已有相关研究报道丝氨酸蛋白酶参与SS2的致病过程，本文中新发现的丝氨酸蛋白酶是否与SS2的毒力相关，尚待进一步研究。

5. 研究计划与进展

第1-3周（2015.8.31-2015.9.20），引物及探针的设计与制备；重组质粒标准品的制备 第4周（2015.9.21-2015.9.27），PCR的建立及条件的优化 第5-12周（2015.9.27-2015.11.22），原核表达目的基因，制备多克隆抗体，测定抗体效价，进行蛋白酶的功能试验。

第13-17周（2015.11.23-2015.12.27），进行重复性实验第18-19周（2015.12.28-2015.1.10），数据分析、整理，撰写论文。