猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

多杀性巴氏杆菌（p.multocida）是引起多种畜禽巴氏杆菌病（pasteurellosis）的病原体，主要使动物发生出血性败血病或传染性肺炎^[1]。本菌广泛分布于世界各地且宿主范围广泛，在同种或不同动物间可相互传染，可以导致禽霍乱、猪肺疫、猪传染性萎缩性鼻炎、牛和水牛的出血性败血症、兔鼻瘘等疫病的流行。人类也可以感染，主要由动物咬伤或抓伤引起^[2]。多杀性巴氏杆菌感染猪时引起的猪肺疫及猪传染性萎缩性鼻炎，均属于我国二类动物疫病。被感染猪呼吸道的正常结构和功能遭到损害，致使机体抵抗力降低，易致其它病原如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副嗜血杆菌、猪流感病毒、猪生殖-呼吸道综合征病毒等的继发感染，引起猪呼吸道综合征；增加猪的死亡率，给养猪业造成极大的经济损失^[3-4]。因此多杀性巴氏杆菌的分离鉴定以及特性分析，对猪巴氏杆菌病的诊断和防控具有重要意义。

免疫接种是预防和控制猪巴氏杆菌病的有效方法，但由于病原菌本身血清型复杂、免疫机制不甚明了，至今国内外尚缺乏理想的疫苗^[5]。传统的细菌分离鉴定方法为兽医病原菌的研究奠定了坚实的基础，药敏试验也为临床用药提供了科学依据；近年来随着分子生物学技术的广泛运用，通过pm特异性引物进行pcr鉴定也已成为准确高效的新途径。国内多杀性巴氏杆菌的分离鉴定和特性分析的研究方法已经较为成熟，常使用发生猪肺疫和猪传染性萎缩性鼻炎的猪场采集的病、死猪的肺、脾脏、心血、淋巴结、鼻拭子等病料进行试验。如徐引地，王治方等从河南省的245家规模化猪场568份病料中分离革兰氏阴性小球杆菌，通过培养特性试验、生化试验和pcr试验分离鉴定到35株多杀性巴氏杆菌^[6]。贺英，储岳峰等对从病死猪肺脏分离所得的典型菌落进行pcr扩增、dna片段回收、克隆重组质粒的序列测定，结果运用blast比对，比对结果与多杀性巴氏杆菌的同源性达100%^[7]。

参考文献：

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

本研究旨在分离、鉴定和纯化猪源多杀性巴氏杆菌并分析其药敏特性，为猪巴氏杆菌病的诊断和防控奠定基础。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

无菌采取江苏省猪传染性萎缩性鼻炎病例的鼻腔棉拭子及猪肺疫病例的肺脏、脾脏组织等病料，划线接种于加有血清和nad的tsa培养基，置于5%的二氧化碳温箱37℃过夜培养，观察细菌的生长情况和菌落特征，挑取不同菌落形态细菌做革兰染色、镜检。挑取菌落大小为1~2mm左右、表面光滑、湿润、呈灰白色、发蓝色荧光的可疑菌落，取上述菌落抹片革兰氏染色后在显微镜下观察, 挑取革兰氏阴性球杆菌或短杆菌菌落于tsa平皿纯化。将疑似菌瑞氏染色，接种mc、ts和血平皿。将可疑菌落做生化试验：接种于果糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、乳糖、山梨醇等微量生化发酵管中，37 ℃培养48h，观察并记录试验结果。将初步鉴定的细菌用pcr方法确定后做药敏试验：菌液适当稀释后接种于tsa平皿，涂布棒均与涂布后选取相应的抗生素的药敏纸片贴于培养基上，置于5%的二氧化碳温箱37℃过夜培养，测量抑菌环直径并判定结果。

技术路线及实验方案:

4. 研究创新点

不仅利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增产物以达到鉴定巴氏杆菌得目的，同时也利用药敏试验为临床用药提供参考。

5. 研究计划与进展

2015.09~2015.10设计试验方案，进行试验前准备，熟悉试验流程和操作；

2015.10~2015~12进行和记录实验，提交中期报告，完成中期检查；